Gel Clot یکی از روش‌های رایج برای اندازه‌گیری اندوتوکسین است. اندوتوکسین یک مولکول سمی است که در دیواره‌های  باکتری گرم منفی یافت می‌شود. این مولکول به ویژه در هنگامی که باکتری‌ها از بین می‌روند و یا تجزیه می‌شوند آزاد شده و می‌توانند وارد جریان خون شوند. اندوتوکسین بسیار خطرناک بوده، در حدی که اگر مقدار کمی از آن وارد بدن حیوانات و یا انسان شود می‌تواند عوارض بسیار شدیدی به بدن مثل تب و التهاب، شوک سپتیک، … می‌شود. به همین دلیل کنترل و شناسایی اندتوکسین‌ها امری بسیار مهم و ضروری است.

برای اندازه‌گیری اندوتوکسین سه روش وجود دارد: Chromogenic ، Turbidity و  Gel Clot.  در Chromogenic اندازه‌گیری بر اساس واکنش شیمیایی بین اندوتوکسین و کروموژن، که نتیجه عملیات آن، ماده رنگی تولید می‌شود. روش Turbidity حضور اندوتوکسین باعث تغییر کدورت یا کدری در محلول می‌شود، که این تغییر کدورت با استفاده دستگاه کدورت سنج مثل اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری می‌شود. در Gel Clot که جزء رایج‌ترین روش‌ها است، این روش بر اساس Limulus amebocyte lysate یا LAL می‌باشد. Limulus Polyphemus دارای یک سیستم منحصر به فرد است که در حضور اندوتوکسین‌ها یک واکنش انعقادی ایجاد می‌کند. در ادامه بیشتر راجب به این روش می‌گوییم.

Gel Clot

این روش بر اساس Limulus amebocyte lysate یا LAL طراحی شده است. Limulus Polyphemus دارای یک سیستم منحصر به فرد است که در حضور اندوتوکسین‌ها یک واکنش انعقادی ایجاد می‌کند. Amebocyte lysate یا لیزات آمیبوسیت خرچنگ حاوی آنزیم‌های انعقادی خاصی است که در حضور اندوتوکسین فعال می‌شوند و باعث تشکیل ژل جامد می‌شود.

مزایا

روش Gel Clot چندین مزیت دارد که آن را به یک روش محبوب در آزمایشگاه‌های تشخیص اندوتوکسین تبدیل کرده است. این مزیت‌ها شامل:

• سادگی و سرعت: این روش نسبت به دیگر تکنیک‌های تشخیصی ساده‌تر است و تجهیزات پیچیده نیاز ندارد.
• هزینه کمتر:  نسبت به روش‌های پیشرفته‌تر مانند کروموژنیک یا توربیدیمتریک، هزینه‌های مربوط به این روش کمتر است.
• قابلیت انجام در شرایط معمول آزمایشگاهی:  نیاز به تجهیزات خاص و گران‌قیمت ندارد و در آزمایشگاه‌های معمولی قابل انجام است.

برندهای تولید کننده محصولات با روش Gel Clot

شرکت‌های متعددی در زمینه تولید محصولات با این روش هستند. این شرکت‌ها کیت‌ها و معرف‌های مورد نیاز برای انجام آزمون Gel Clot را تولید و عرضه می‌کنند. برخی از این شرکت‌ها شامل:

Lonza

شرکت Lonza یکی از شرکت‌های پیشرو در زمینه محصولات بیولوژیکی، داروسازی و تجهیزات آزمایشگاهی است.  این شرکت طیف گسترده‌ای از محصولات و خدمات را برای صنایع دارویی، بیوتکنولوژی و تحقیقاتی ارائه می‌دهد. برخی از محصولات شرکت Lonza مانند: کیت سنجش اندوتوکسین LONZA، کیت تشخیص اندوتوکسین Lonza N283-06، کیت تشخیص اندوتوکسین Lonza N283-125، تست اندوتوکسین و پیروژن.

اندوسیف

برند اندوسیف به عنوان یکی از تولیدکنندگان پیشرو در زمینه کیت‌ها و تجهیزات آزمایشگاهی برای شناسایی اندوتوکسین‌های باکتریایی فعالیت می‌کند. این برند به دلیل تمرکز بر تکنولوژی‌های پیشرفته و رویکردهای نوین در زمینه تشخیص اندوتوکسین، در میان محققان و کارشناسان آزمایشگاهی شهرت یافته است. برخی از محصولات این شرکت شامل: کیت سنجش اندوتوکسین اندوسیف با حساسیت 0.06، کیت سنجش اندوتوکسین اندوسیف با حساسیت 0.03.

Cape cod

شرکت Cape cod قدیمی‌ترین شرکت‌های فعال در زمینه تولید محصولات LAL برای شناسایی اندوتوکسین‌ها محسوب می‌شود. این شرکت اولین تولیدکننده تجاری لیزات LAL بود و همچنان به عنوان یکی از رهبران بازار در این زمینه شناخته می‌شود. محصولات ACC در زمینه‌های مختلف از جمله داروسازی، بیوتکنولوژی، و صنایع غذایی برای اطمینان از عدم وجود آلودگی اندوتوکسینی در محصولات استفاده می‌شوند. نمونه محصولات این شرکت می‌توان به کیت سینگل تست از برند Cape Cod با کد GS006-5 حساسیت 0.06 و کیت سینگل تست از برند Cape Cod با حساسیت 0.125 کد GS125-5 اشاره کرد.

روش آزمون Gel Clot

هر آزمایش باید شامل رقیق‌سازی‌های سریالی دو برابری از کنترل استاندارد (CSE) باشد که حساسیت لیزات برچسب‌گذاری شده را پوشش دهد. همچنین، رقیق‌سازی‌های نمونه آزمایش و آب واکنش LAL به عنوان کنترل منفی باید در نظر گرفته شوند. برای جلوگیری از آلودگی میکروبی یا اندوتوکسین، ۰.۱۰ میلی‌لیتر از استاندارد، نمونه یا آب را با احتیاط به لوله واکنش ۱۰ × ۷۵ میلی‌متری منتقل کنید.

سپس ۰.۱۰ میلی‌لیتر از لیزات بازسازی‌شده را به هر لوله اضافه کنید، ابتدا به لوله کنترل خالی و سپس از رقیق‌سازی با کمترین غلظت اندوتوکسین به بالاترین غلظت بروید. بلافاصله پس از افزودن لیزات به هر لوله، محتویات را به‌خوبی مخلوط کرده و لوله را در حمام آب داغ غیرگردشی یا حمام حرارت خشک با دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد ± ۱ درجه قرار دهید. این روند باید برای هر رقیق‌سازی اندوتوکسین دنبال شود.

نمونه تست ناشناخته باید به‌طور موازی با کنترل استاندارد (CSE)  آزمایش شود. آزمون می‌تواند به‌عنوان یک تست بله/خیر در یک رقیق‌سازی واحد یا به‌صورت تست کمی از طریق سری رقیق‌سازی انجام شود. زمان انکوباسیون باید از زمانی که هر لوله در حمام ۳۷ درجه سانتی‌گراد ± ۱ درجه قرار می‌گیرد تعیین شود. لوله‌های آزمون نباید از انکوباسیون خارج شوند یا قبل از زمان مشخص شده برای خواندن تست جابجا شوند. پس از ۶۰ دقیقه (±۲ دقیقه) انکوباسیون، هر لوله را با احتیاط بردارید و به حالت معکوس ۱۸۰ درجه قرار دهید.

نتیجه آزمایش

1) واکنش مثبت با تشکیل یک ژل محکم مشخص می‌شود که هنگام برگرداندن لوله به‌طور موقت دست نخورده باقی می‌ماند.( اگر در آزمایش یک ژل محکم تشکیل شود و این ژل هنگام برگرداندن لوله به حالت معکوس باقی بماند، نشان‌دهنده وجود اندوتوکسین و در نتیجه یک واکنش مثبت است.)

2)  واکنش منفی با عدم وجود لخته جامد پس از برگرداندن مشخص می‌شود. ممکن است لیزات افزایش کدورت یا ویسکوزیته را نشان دهد. این نتیجه منفی در نظر گرفته می‌شود.( اگر پس از برگرداندن لوله هیچ لخته جامدی وجود نداشته باشد و فقط افزایش کدورت یا غلظت مشاهده شود، این نشان‌دهنده عدم وجود اندوتوکسین است و نتیجه منفی محسوب می‌شود.)

3) برای تحلیل بهتر و مستندسازی، نتایج هر لوله باید به‌صورت منظم در فرم‌های مشخص ثبت شوند، تا بتوان به راحتی بررسی کرد که کدام نمونه‌ها مثبت و کدام‌ها منفی هستند.

 تأیید حساسیت لیزات

• هر ویال LAL (آزمایش لیزات آمیب) دارای برچسبی است که حساسیت آن را نشان می‌دهد و این حساسیت به واحدهای اندوتوکسین (EU) بیان می‌شود.
• کاربران باید این حساسیت را با استفاده از یک استاندارد شناخته شده دوباره بررسی کنند. این کار به اطمینان از دقت و صحت نتایج آزمایش کمک می‌کند.
• برای تأیید حساسیت، غلظت دو برابر از استاندارد اندوتوکسین (CSE) تهیه می‌شود که شامل حساسیت لیزات برچسب‌گذاری شده است. هر غلظت و همچنین یک نمونه کنترل منفی (آب) باید در چهار تکرار آزمایش شوند تا دقت نتایج افزایش یابد. غلظت نهایی به‌عنوان آخرین رقت اندوتوکسین که هنوز نتیجه مثبت می‌دهد، تعیین می‌شود.

نمونه نتیجه آزمایش سنجش Labeled Lysate Sensitivity  0.125 EU/ml

حساسیت لیزات با تعیین میانگین حسابی نقطه پایانی محاسبه می‌شود. هر مقدار نقطه پایانی به log10 تبدیل می‌شود. هر  log10 میانگین‌گیری شده و حساسیت لیزات به‌عنوان آنتی‌لوگ10 این میانگین مقدار log تعیین می‌شود.

محاسبه میانگین حسابی نقطه پایانی

تنوع قابل قبول از نیم تا دو برابر حساسیت لیزات برچسب شده است.

تشخیص اندوتوکسین در یک نمونه ناشناخته

برای تعیین غلظت آندوتوکسین در یک محلول ناشناخته، سری غلظت‌های دو برابری از نمونه را آزمایش کنید تا به نقطه پایانی برسید. میانگین حسابی رقیق‌سازی را مانند قبل محاسبه کرده و آن را در حساسیت لیزات برچسب‌گذاری شده ضرب کنید.

تعیین غلظت اندوتوکسین

Lysate Sensitivity = 0.125 EU/ml

Endotoxin Concentration = lysate sensitivity × endpoint dilution

= 0.125 EU/ml × 11.4 = 1.4EU/ml

(غلظت اندوتوکسین = حساسیت لیزات × غلظت نقطه پایانی

= 0.125 EU/ml × 11.4 = 1.4 EU/ml)

کاربردهای روش Gel Clot

• صنایع داروسازی: برای اطمینان از عدم وجود اندوتوکسین‌ها در محصولات تزریقی، داروهای داخل وریدی، و سایر فرآورده‌های حساس.
• صنایع بیوتکنولوژی: برای بررسی آلودگی اندوتوکسینی در محصولات بیولوژیکی مانند پروتئین‌های نوترکیب، آنتی‌بادی‌ها، و واکسن‌ها.
• صنایع غذایی و آشامیدنی: برای ارزیابی آلودگی میکروبی و اطمینان از ایمنی محصولات.
• تحقیقات علمی: برای بررسی پاسخ ایمنی در مواجهه با اندوتوکسین‌ها و مطالعه فرآیندهای التهابی.

روش Gel Clot یک تکنیک ساده، موثر و مقرون به‌صرفه برای تشخیص و اندازه‌گیری اندوتوکسین‌ها است. این روش با استفاده Limulus amebocyte lysate یا LAL و واکنش انعقادی ناشی از حضور اندوتوکسین، به شناسایی این ترکیبات در محصولات دارویی، بیولوژیکی و غذایی کمک می‌کند. و امروزه به طور گسترده استفاده می‌شود.