HPLC

قبل از معرفی دستگاه ستون HPLC بهتر است با اصطلاح HPLC در شیمی تحلیلی آشنا شویم، آنالیز(High Performance Liquid Chromatography) HPLC  کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا تکنیکی در شیمی تحلیلی است که برای جداسازی، شناسایی و تعیین کمیت اجزای خاص در مخلوط های مواد غذایی، مواد شیمیایی، دارویی، بیولوژیکی و غیره ، که در محلول های مایع حل شده اند استفاده می شود. HPLC در تحلیل فارماکولوژیک، شناسایی ترکیبات آلی، تحلیل مواد غذایی، تحلیل بیوشیمیایی و آنالیز محیط زیستی استفاده می شود.

برخی بخش های دستگاه: HPLC

• پمپ (Pump)
• مخازن حلال  (Solvent tanks)
• انژکتور(Injector)
• ستون(Column)
• آشکار ساز (Detector)
• کنترل کننده(Controller)
• گازگیر(Degasser)

 کاربرد های HPLC

·        تولید و ساخت

HPLC، کاربرد زیادی در علوم آزمایشگاهی و بالینی دارد. ستون HPLC ، یک روش معمول و کارآمد در صنعت داروسازی است. زیرا، محصول با درصد خلوص بالا را ارائه می دهد. اچ پی ال سی، محصولات خالص تولید می کند. اما همیشه روش اصلی مورد استفاده در تولید مواد دارویی فله ای نیست.

طبق فارماکوپه اروپا، HPLC فقط در ۱۵.۵ ٪ از سنتزها کاربرد دارد. با این حال، این ماده در ۴۴٪ از سنتزها در فارماکوپه ایالات متحده نقش دارد. علت این تفاوت در محدودیت پولی و زمانی است. زیرا  HPLC در مقیاس بزرگ می تواند یک روش گران قیمت باشد.

·        پژوهش

روش HPLC در مشاهده گونه های مختلف در نمونه های جمع آوری شده نیز مفید است. هنگام جستجوی اطلاعات در مورد هویت گونه ها، نیاز به استفاده از راه حل های استاندارد است. HPLC روشی برای تأیید نتایج واکنش های سنتز استفاده می شود؛ زیرا درصد خلوص در این نوع تحقیقات ضروری است.

·        پزشکی

استفاده پزشکی از HPLC می تواند شامل تجزیه و تحلیل دارو باشد. اما بیشتر در گروه تجزیه و تحلیل مواد مغذی قرار می گیرد، که متداول ترین تجزیه و تحلیل ، تجزیه تحلیل ادرار و خون برای اکثر آنالیزهای پزشکی با HPLC است. استفاده دیگر این روش تشخیص مولکول ها که برای مطالعات بالینی هستند. برای مثال تشخیص ویتامین D در آزمایش خون کودک.

ستون HPLC

ستون HPLC دستگاهی است که در کروماتوگرافی قلب آنالیز HPLC است و نقش کلیدی در فرآیند جداسازی ترکیبات شیمیایی ایفا می‌کند. طول ستون‌های HPLC  بین ۱۰ تا ۳۰ سانتی متر است که آن‌‌ها را از جنس فولاد ضد زنگ یا استیل می‌سازند.

ستون HPLC چطور عمل می‌کند؟

برای بسته‌بندی ستون HPLC از یک ماده تک عنصری استفاده می‌کند. این ماده از پلیمر یا سیلیس (دارای ذرات جامد) ساخته می‌شود. در دستگاه کروماتوگرافی یک پمپ هم وجود دارد که ماده را به داخل ستون حرکت می‌ دهد. این دستگاه و ستون آن در جدا کردن محلول و ذرات کوچکتر موفق‌تر عمل می‌کند.

انواع ستون‌های HPLC

۱ . ستون HPLC فاز عادی یا نرمال

در این ستون‌های HPLC ، فاز ثابت قطبی بیشتر از فاز متحرک بوده است؛ که برای این کار از ماده سیلیس استفاده می‌کنند و برای تأمین فاز متحرک هم موادی مثل کلروفرم، هگزان و متیلن کلرید کاربرد دارد.

برای اینکه ترکیبات محلول از هم جدا شود، اصل قطبیت اجزای نمونه وارد عمل می‌شود. به این صورت که ترکیبات محلول نمونه با فاز ثابت قطبی تعامل بیشتری دارند، جدا می‌شوند.

مزايای استفاده از ستون HPLC فاز نرمال

• از حلال غير قطبى می توان برای حل یک نمونه استفاده کرد.
• برای جداسازى ايزومر و مولكول های بسيار آب دوست يا آبگريز مناسب است.
• با استفاده از حلال هاى با ويسكوزيته پايين مى توان سرعت جريان بالاترى را داشت.
• مى تواند براى تركيباتى كه مى توانند در آب تجزيه شوند استفاده شود.

معايب استفاده از ستون HPLC فاز نرمال

• براى تجزيه وتحليل طيف وسيعى از تركيبات مناسب نيست.
• به دليل اختلاط محلول در حلال امكان شستشوی گرادیانت وجود ندارد.
• تشكيل حباب وتبخير مى تواند در اثر حلال هاى نقطه جوش كمترى ايجاد شود.
• كنترل قدرت حلال دشوار است.

کاربرد ستون های HPLC مایع نرمال فاز :

قندها ، اولیگو ساکاریدها ، دارو ها ، داروهای قطبی ، گلیکان ها ، ویتامین های محلول در آب ، داروهای شیمی درمانی و غیره

۲ . ستون HPLC فاز معکوس

 ستون فاز معکوس برخلاف ستون فاز عادی عمل می‌کند. برای ستون‌های HPLC فاز معکوس، از هیدروکربن‌های پیوند  و سایر هیدروکربن‌های غیرقطبی به‌عنوان فاز ثابت استفاده می‌شود.

برای اینکه عناصر یک محلول در ستون‌های فاز معکوس جدا سازی انجام دهد، پروسه قطبیت اجزای نمونه صورت می‌گیرد. ترکیبات محلول که با فاز متحرک تعامل بیشتری دارند، جدا می‌شوند. پس هر عنصری که کمتر در معرض تعامل با فاز ثابت قطبی باشد، راحت از آن جدا می‌شود.

مزاياى ستون هاى HPLC فاز معكوس

• فرآيند Modify راحت تر انجام مى شود
• جایگشت و تركیب بیشتر امکان پذیر است
• كروماتوگرافی فاز معکوس حلاليت بهتری را برای تجزيه كننده ها قطبی فراهم می کند
• از حلال های غير سمى استفاده می شود
• روشى را براى حذف آلاينده ها و مواد افزودنى فاز متحرک ارائه مى دهد وبا كمبود تبخير حلال ، به موقع نمونه را بازيابى مى كند
• قادر به استفاده از انتخاب pH برای بهبود جدایی است
• فاز ساكن آبگریز در ستون های HPLC فاز معکوس برای حفظ بیشتر مولكول های آلی به خوبی کارمی کند.

معايب ستون هاى HPLC فاز معكوس

• HPLC مى تواند پرهزينه باشد و به مقدار زيادى مواد آلى گران قیمت نیاز داشته باشد
• HPLC حساسيت كمى نسبت به برخى تركيبات دارد و بعضى از آنها قابل شناسايى نيستند زيرا به طور غيرقابل برگشت جذب مى شوند.
• تجزيه و تحليل تركيبات و آمين های محلول در آب دشوارتر است.
• سيليس ستون فاز معكوس مى تواند در ۷.۵ <pH حل شود.

کاربرد ستون های HPLC مایع فاز معکوس :

۱ . انواع دارو ها , ویتامین های محلول در چربی  (K,E,D,A)

۲ . ویتامین های محلول در آب (B1 ,B2 ,B3 ,B5 ,B6 , B12) ، آنتی بیوتیک ها ، ضد صرع ، اسید آمینه

۳ . اسید چرب ، پپتید ، پروتئین ، آنزیم ، DNA ،  RNA ، نوکلئوتید ، افزودنی های غذایی ، افزودنی های پلیمر و غیره

۳ . ستون HPLC تبادل یونی

نوع دیگری از ستون‌های کروماتوگرافی ستون های HPLC  تبادل یونی است که برای جداسازی ترکیباتی کاربرد دارد و به راحتی یونیزه می‌شوند. فاز متحرک در ستون‌های تبادل یونی، یک مایع قطبی مثل محلول آب و نمک است اما فاز ثابت باید یک ماده اسیدی یا قلیایی با بار مثبت یا منفی باشد. برای اینکه این ستون HPLC بتواند ذرات محلول را جدا کند، بین فاز ثابت باردار و ذرات محلول، نیروی یونی جاذب اتفاق می‌افتد.

کاربرد ستون های HPLC مایع تعویض یونی :

آمینو اسید ها ، پپتید ، پروتئین ، پورین ، پیریمیدین ، نوکلئوزید ، نوکلئوتید ، اولیگو نوکلئوتید ، DNA و RNA ، محصولات PCR و مونوساکارید ، دی ساکارید و غیره

۴ . ستون های HPLC مایع آب گریز

کروماتوگرافی آبگریز (HIC) یک روش راحت در مقایسه با فاز معکوس برای اتصال و دفع پروتئین های آبگریز است. استفاده از فازهای متحرک آبی در HIC اختلال در ساختار پروتئین ایجاد کرده و منجر به فعالیت بهتر می شود. مولکول های زیستی با غلظت زیاد نمک به یک سطح آبگریز ضعیف جذب می شوند و با کاهش شیب نمک شسته می شوند . ستون کروماتوگرافی آبگریز ، برای بهبود عالی فعالیت پروتئین ، بارش نمک را با دقت کروماتوگرافی ترکیب می کند.

کاربرد ستون های HPLC مایع آب گریز

RNA  ریبوزومی ، پروتئین ، اجزای آنتی بادی ، آنتی بیوتیک ، آنزیم ها و غیره

۵ . ستون های HPLC مایع تمایلی

اساس کار ستون های افینیتی ، جداسازی نمونه های پروتئینی است که بسیار پرکاربرد ، گزینش پذیر و مؤثر می باشد. این تکنیک بر پایه اثرات متقابل منحصر به فرد موجود بین یک مولکول و یک لیگاند متصل به یک ماتریکس است .

کاربرد ستون های HPLC مایع تمایل

• کربوهیدرات ها ، کاتکول آمین ، بیو مولکول ها ، پپتید ، پروتئین ، پروتئین های هیستیدین دار ، ایمونو گلوبولین ، پروتئین های شیر ، پروتئین های غشایی
• تراتسفرین ، ریبونوکلئاز ، آنتی ژن ها ، آنتی بادی ها ، آنزیم ها و غیره

راهنمای خرید ستون HPLC

برای اینکه یک ستون HPLC  مناسب را خریداری کنید، باید ابتدا انواع آن را بشناسید. اما در کنار این مورد، دانستن اطلاعاتی در مورد قطر و طول داخلی ستون، اندازه منافذ و مهره نیز اهمیت دارد.

توجه به نوع ستون HPLC

۱ . فاز عادی یا نرمال

۲ . فاز معکوس

۳ . تبادل یونی

۴ . مایع آب گریز

۵ . مایع تمایلی

توجه به مواد تشکیل‌دهنده ستون HPLC

• سیلیکا
• پلیمرها

طول و قطر داخلی ستون‌های HPLC

این محصول از نظر طول و قطر داخلی انواع مختلفی دارد. این دو المان بر روی کارایی، حساسیت و سرعت آنالیز دستگاه HPLC تاثیر زیادی دارد. حالا اگر قرار باشد ستون کروماتوگرافی تهیه کنید، باید نوع کاربرد خود را از آن مشخص کنید. اگر حساسیت کار شما بالاست و یا نمونه مورد استفاده کم است، از ستون‌های باریک و کوتاه استفاده کنید. همچنین اگر می‌خواهید زمان تحلیل کوتاه‌تر و مصرف و دفع مواد حلال کمتر باشد، ستون‌های باریک و کوتاه برایتان مناسب‌تر است.

تطابق با نمونه و شرایط کاری

در خرید ستون های HPLC بهتر است به نکاتی از جمله نوع نمونه و شرایط کاری توجه می شود . منظور از نوع نمونه استفاده شده در ستون HPLC ترکیبات هدف ، قطبیت و وزن مولکولی است ؛ و منظور از شرایط کاری ستون های کروماتوگرافی  pH، دما و فشار است.

توجه به اندازه مهره ستون‌های HPLC

یکی دیگر از نکات مهم در انتخاب ستون مناسب کروماتوگرافی توجه به اندازه مهره‌های محصول است. مهره‌ها در فاز ثابت معمولاً بین 2-10 میکرومتر هستند. مهره‌های کوچک‌تر می‌توانند وضوح و کارایی بهتری داشته باشند. اما فشار برگشتی را زیاد می‌کنند.

اندازه منافذ ستون HPLC

در زمان خرید ستون HPLC توجه به اندازه منافذ یک نکته بسیار مهمی است. زیرا هر چقدر منافذ کوچکتر باشند، سطح بزرگتری از ذرات را در ستون به خود اختصاص می‌دهند. حالا منافذ کوچکتر ماندگاری نمونه را افزایش می‌دهند و در نهایت بر عملکرد کروماتوگرافی تأثیر مثبت می‌گذارند

پارامترهای فنی و سازگاری

سازگاری شیمیایی: مطمئن شوید که ستون HPLC انتخابی با فاز متحرک و نمونه سازگار است.

تحمل فشار: ستون کروماتوگرافی باید تحمل فشار سیستم HPLC شما را داشته باشد.

پایداری دما: برخی ستون‌های HPLC برای کار در دماهای بالا طراحی شده‌اند.

برای خرید انواع ستون‌های HPLC می‌توانید از سایت ما از طریق این لینک اقدام به خرید این دستگاه کنید.